2019年10月28日国家药品监督管理局发布了《医疗器械已知可沥滤物测定方法验证及确认注册技术审查指导原则》，其目的是提出对医疗器械已知可沥滤物测定方法研究的一般要求。本文通过对可沥滤物的基本概念、测定意义、试验条件、方法验证等方面的介绍，并结合实际案例进行解析，供相关单位进行可沥滤物研究时提供参考。

一、什么是可沥滤物？

医疗器械的可沥滤物（Leachables）是指医疗器械或材料在临床使用过程中释放出的物质的统称，一般包括灭菌残留剂、工艺残留物、降解产物以及材料中的单体及添加剂（如稳定剂、抗氧化剂、增塑剂、着色剂）等。可沥滤物分为根据相关信息识别的已知可沥滤物（Target Leachables）和根据未知物研究体系鉴别的未知可沥滤物(Unknown Leachables)）。

二、为什么要进行可沥滤物测定？

在医疗器械产品与人体接触并发挥作用的过程中，可沥滤物也在或短期或长期地对人体产生包括生物安全性在内的安全性方面危害，所以需要对医疗器械的可沥滤物进行风险评价。

另一方面，可沥滤物的安全性研究也是医疗器械生物学评价工作的重要内容，安全性研究的结果还可以用于支持产品或材料等同性判定、稳定性研究等。

三、如何进行可沥滤物安全性评价？

首先应进行充分的信息收集以获得可沥滤物信息，收集的内容一般包括器械的结构及材料组成、来自原材料供应商的信息、拟研究材料/器械的理化特性及与可沥滤物相关的文献信息、器械的生产工艺信息、已有的历史数据库信息、临床应用信息等。

如果可沥滤物已知且为原材料或最终医疗器械生产过程中添加的添加剂，应进一步确认该添加剂在原材料或最终医疗器械中的添加总量是否超过该已知可沥滤物的允许限量。如为否，则一般无需对该可沥滤物本身做进一步的研究。如果超过了允许限量，则应通过浸提物和可沥滤物研究（Extractable & Leachable Study，E&L Study）获得可浸提物/可沥滤物基本信息（Extractables or Leachables Profile）及其最大释放量，并根据其允许限量形成完整的安全性评价报告。

值得注意的是，可沥滤物来源可能不仅是器械原材料及工艺信息中提供的添加剂、单体、加工助剂本身，某些情况下，器械及其原材料在生产、贮存及使用等过程中产生的上述化学物质的水解、降解或反应产物等宜同时纳入可沥滤物风险评估的考虑。

对于E&L研究、允许限量建立、安全性研究的方法及流程等，可参考后续《未知可沥滤物评价方法建立及表征技术审查指导原则》《已知可沥滤物允许限量建立技术审查指导原则》《毒理学关注阈值在医疗器械风险管理中的应用指南》等相关指南进行。

四、可沥滤物研究的试验条件如何确定？

可沥滤物是临床使用过程中从医疗器械或材料中释放出的物质统称，因此通过可沥滤物研究最能代表实际应用过程中使用者的接触量。但由于实际条件的挑战（包括临床接触途径及使用方法的多样性和复杂性、临床样本采集的伦理问题等），对大部分器械来说，很难进行真正意义上的可沥滤物研究，因此某些情况下宜通过浸提试验（Extract Test）替代可沥滤物研究。但是务必对浸提方式进行论述，证明浸提条件是严于或模拟了器械临床最坏使用条件（包括浸提方式、溶剂、时间、温度、流速等），具体可参考《医疗器械已知可沥滤物测定方法验证及确认注册技术审查指导原则》（2019年第78号）论述，此处不再展开。

五、分析测试方法是否一定要进行方法学验证？

不一定。对于某些已经建立起标准检测方法的研究物质，优先选用标准方法，如国际标准、国家标准等，但申请人仍需对所申报产品采用上述国际标准、国家标准的适用范围进行确认。对于无标准检测方法的可沥滤物研究，企业需开发新的检测方法并进行方法学验证及确认工作。

对于已经建立合适的分析方法并进行验证后，新的实验室采用该方法进行检验前还应进行方法比对性测试，以确保方法的转移的可靠性。比对性测试需要考虑的因素包括样品数量、浓度级别、重复次数等。

在某些情况下, 如原材料的合成工艺改变、分析方法发生改变等，企业应进行充分的风险评估，并根据评估结果考虑是否需要对分析方法再次进行全面的或部分的再验证,以确保分析方法可行。

六、是否有可参考的案例？

对于已知可沥滤物测定，企业可参考指导原则要求及附件中案例（附件），并根据企业拟研究产品/物质的基本特点进行测定。

对于未知可沥滤物测定，企业可参考随后发布的其他相关指导原则。

附件：一次性使用聚氯乙烯输血器中可沥滤物邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）增塑剂的研究（下载）

附件：

一次性使用聚氯乙烯输血器中可沥滤物邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）增塑剂的研究

一、概述

DEHP，是Di-(2-ethylhexyl) phthalate的缩写，全名为邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯。

分子式：C24H38O4

结构式：

分子量：390.6

CAS编号：117- 81-7

物理状态：常温下为无色无臭液体。不溶于水，溶于乙醚、乙醇、矿物油等。

熔点：-50℃ 或-55℃

沸点:在5mm Hg时大约230℃ (BASF1994b;Clayoton 1981,in HSDB 2005)

在1013hP时385℃

蒸汽压：0.000034 Pa在20℃

水溶性：0.003mg/L在20℃

醇溶性：>100mg/mL( 95%乙醇， 22℃)

密度：0.986g/cm³at20℃( IARC1982，in HSDB 2005)

由于聚氯乙烯（PVC） 材料本身质地较硬且加工难度较大，为了使PVC制品柔软往往加入大量的增塑剂。在常用的增塑剂中，DEHP由于其与优异的增塑性能、易获得性以及和PVC 的良好相容性，使得其在成为输血器中最常见的增塑剂。

DEHP一般先与PVC树脂以及其他添加剂通过共混等方式制备含有DEHP的PVC粒料，在此共混过程中，其不以共价键结合而是物理结合于PVC 分子上。一般来说，在软质PVC粒料中DEHP的质量百分比可高达20%~50%。

注：材料组成及牌号等信息可能涉及企业专利等信息，此处省略。但在正式的递交文件中应予以明确（如适用）。

二、浸提液制备的论述

2.1总则

由于输血器中的DEHP为脂溶性物质，易溶于乙醇，其输血器中含量可高达21.60%-33.37%。一次性使用输血器在临床上为只接触血液的器械，对于材料中可沥滤物DEHP的研究，原则上应选择血液作为浸提介质，采用临床相同使用条件进行滴注。由于难以收集足够的血液或招募足够的志愿者用于研究，因此使用血液或血液成分作为浸提介质来评估器械释放的DEHP不是很实际。因而需选择一个合适的替代溶剂，本研究拟选择密度为0.9373至0.9378g/mL的乙醇/水混合溶液作为替代浸提溶剂，为了验证乙醇/水混合溶液的浸提能力严于血液，进行了以下试验验证。同时一次性使用塑料血袋的国际标准（ISO 3826-1）中采用密度为0.9373-0.9378g/mL的乙醇水混合物作为血液替代溶剂测定血袋中DEHP的释放量。

2.2浸提能力的验证

为了验证乙醇/水混合溶液的浸提能力严于血液，收集来自三名健康志愿者的血液样品，用EDTA盐抗凝并储存在玻璃容器中。这些血样作为第一组用于模拟实际使用情况。第二组采用密度（ρ）为0.9378g/mL（20℃）的水/乙醇混合物在相同条件下浸提DEHP（相同的提取介质体积，相同的滴落速率和相同的滴度、相同环境温度）。测定结果见表1。

表1血液和水/乙醇混合物提取能力比较

血液 (DEHP 释放量, mg)

乙醇/水 (DEHP 释放量, mg)

1a

2a

3a

0.110

0.068

0.073

2.84

a: 数字1,2和3对应于来自三名志愿者的全血样品。

由上述结果可以看出乙醇/水混合溶液的提取能力远高于血液。因而，对该产品选择乙醇/水混合溶液作为浸提溶液。

解读：应结合器械临床使用情况选择合适的浸提方式，若选择使用替代溶剂进行浸提，适用时，应结合可沥滤物的性质通过论述或试验方式证明，替代溶剂的浸提能力严于临床接触的介质。

三、分析方法

3.1 仪器及参数：

气相色谱质谱联用仪：安捷伦7890 GC和配备电子电离（EI）源和四极杆分析仪的安捷伦 5975C质谱仪。

色谱柱:HP-5MS（30m×0.25mm×0.25μm，Agilent J＆W GC柱，USA）；

扫描方式：溶剂延迟时间3.5min，全扫模式45-450amu（定性）和选择离子扫描m / z = 149（定量）；

分流模式：分流比5:1；流速:1.5mL / min；进样量：1μL/样品；

柱温箱条件：起始温度150℃，保持0.5分钟，然后将以20℃/分钟升至280℃，保持7分钟。

3.2方法学验证

3.2.1专属性

分别取DEHP标准溶液、乙醇/水空白对照和正己烷溶剂进行分析。色谱图如下：

图1 SIM模式下DEHP标准溶液（10μg/ mL）的色谱图

图2 SIM模式下乙醇/水空白对照的色谱图

图3在SIM模式下筛选的正己烷试剂的色谱图

由于各种邻苯二甲酸酯的广泛使用，使得其在环境中广泛分布，如空气、水、土壤、灰尘、沉积物、海产品和人体组织。在测试过程中，乙醇/水的空白对照有DEHP的响应，但是因其响应值较低不会对结果测定造成干扰。

解读：确认试验中所用到的溶剂体系及浸提液基质均未对DEHP的测定产生影响。

3.2.2线性及范围

以正己烷作为溶剂时，DEHP的线性范围为0.1-200μg/ mL。 相关系数大于0.999。实际工作中应根据待测物浓度选择合适的工作标准曲线范围。

解读：DEHP血液接触途径TI值为0.6mg/kg/day，由于输血器可用于婴儿，按临床最严格应用人群计算，根据GB/T 16886.17，取婴儿的默认体重为3.5kg, 则婴儿的可耐受暴露量=2.1mg/day（0.6mg/kg/天*3.5）。婴儿一天最大输血量按临床最差情况350mL计，则溶液中最低浓度为6μg/ mL。线性最低点0.1 μg/ mL可以满足最具挑战性人群的评价要求。

3.2.3重复性

为了验证重复性，使用具有四种不同浓度水平的样品溶液来表示0.1-200μg/ mL的线性范围内的高，中，低和极低浓度，并且在每种浓度重复测定3次。结果见表2。

表2 重复性验证结果

浓度 (μg/mL)

乙醇/水（n=3）

RSD（%）

血液（n=3）

RSD（%）

极低 (0.1)

2.33

3.88

低 (1.0)

4.51

6.71

中 (10)

8.80

0.57

中（100）

7.16

2.24

高 (180,200a)

5.02

7.86

a: 乙醇/水和血液样本中DEHP加入量分别为180μg/ mL和200μg/ mL

解读：覆盖线性范围内高、中、低三种浓度。

注：乙醇/水和血液样本中部分较高浓度水平的3份样品的测定RSD值在5.02%-8.80%之间，该结果来自乙醇/水和血液样本的浸提溶液，样本本底较为复杂，除此之外，该RSD值还涵盖了样本的真空干燥、复溶等复杂处理过程。同时考虑到对某些医疗器械，已知可沥滤物的浸提结果本身存在个体差异，因而，本指导原则在考虑方法精密度时，描述为“同一份均匀供试品溶液，经多次取样测定所得结果之间的接近程度”，重点考察在“同一均匀供试品检验液”下，检验方法能够达到的精密度。

3.2.4回收率

此外，采用回收率来评估方法的准确。回收率测定为测定5个不同浓度水平的加标样品，每个浓度水平重复3次， 结果见表3。

表3 回收率验证结果

加标浓度 μg/mL

回收率

乙醇/水 (n = 3)

血液 (n = 3)

回收率 (%)

RSD (%)

回收率 (%)

RSD (%)

0.1

94.23

2.33

92.43

3.88

1

94.23

4.51

91.04

6.71

10

101.53

8.80

98.90

0.57

100

89.58

7.16

98.15

2.24

180，200a

94.60

5.02

95.35

7.86

a: 乙醇/水和血液样本中DEHP加入量分别为180μg/mL和200μg/mL

解读：覆盖线性范围内高、中、低三种浓度，并同时获得样本中精密度验证结果。

3.2.5检测限（LOD）和定量限（LOQ）

由于环境背景中存在的DEHP 背景水平影响LOD和LOQ评估。当使用经过筛选并发现几乎没有背景DEHP的正己烷时，制备一系列极低浓度水平的DEHP标准品，采用信噪比法3：1和10：1估计LOD和LOQ，SIM模式下方法的LOD和LOQ分别约为1ng/mL和2.5ng/mL。然而由于乙醇/水中存在DEHP采用信噪比法评估可能不是很准确。因此本研究中关于LOD和LOQ值评估参考ICH Q2（R1）6.3和7.3中规定的方法，并分别使用如下计算公式：

其中δ=响应的标准偏差，S =校准曲线的斜率

本研究通过进样空白样品（乙醇/水混合物和全血），每种空白样本重复10次计算响应的标准偏差来获得δ值。 本研究中计算的LOD和LOQ值分别为：血液样本为3.08ng/mL和9.35ng/mL，乙醇/水混合物为2.91ng/mL和8.81ng/mL。 

试剂筛选结果表明，相同级别试剂可能存在不同的DEHP背景水平。 因此，可能需要在供应商变更甚至批号更改时逐个报告DEHP的 LOD和LOQ值。

解读：血液样本和乙醇/水样本中检测限均可满足临床最挑战应用人群的毒理学评估要求。

3.3样品测定结果

使用乙醇/水混合溶液和血液分别模拟临床使用方式进行样品制备，采用所建立的GC-MS方法测定对浸提液进行测定，测定结果见表5。

表5 样品测定结果

产品名称

浸提溶剂

DEHP释放量，mg

一次性使用输血器

乙醇/水混合溶液

2.84

血液

0.068-0.073

注：使用100mL提取介质（水/乙醇混合物和血液）。试验用血液来自三名健康志愿者

解读：根据乙醇/水样品液中浓度为：28.4 μg/mL，血液样本中浓度为：0.68-0.73 μg/mL，线性范围0.1 μg/mL -200 μg/mL，供试品溶液中测定浓度在线性范围内。

四、结论

本研究建立了GC-MS方法用于测定替代溶剂和全血中DEHP的量，产品中DEHP 的释放量为2.84mg/套（乙醇/水混合溶液）。根据FDA DEHP安全性评估文件，肠外途径的DEHP耐受摄入量（TI）值为0.6 mg / kg（体重）/天，取成人体重70 kg，儿童10公斤，新生儿3.5公斤（ISO 10993-17 2002）作为默认值。计算人体DEHP可耐受暴露量分别为：成人42毫克/天（0.6mg/kg/天*70），儿童6毫克/天（0.6mg/kg/天*10）和新生儿2.1毫克/天（0.6mg/kg/天*3.5）。测定结果均低于成人的可耐受暴露量，替代溶剂的结果大于新生儿的可耐受暴露量值。

解读：如果选择使用替代溶剂获得的结果超过了可耐受暴露量值，则应考虑使用临床接触的介质重新进行研究。当然，在可行的情况下，也可以直接采用临床接触介质进行可沥滤物溶出量研究。